目前，隐球菌病的发病率在发展中国家尤其高，据统计，每年大约有100万人感染，约65万人在感染后3个月内死亡^[1]，使得新生隐球菌成为全球致死率最高的真菌。隐球菌病常见于实体器官移植受者、恶性肿瘤患者、艾滋病患者、静脉注射吸毒者以及各种自身免疫性疾病需要免疫抑制药物治疗的人群^[2-4]。随着新的自身免疫和恶性肿瘤免疫抑制治疗的发展，隐球菌病的高危感染人群正在扩大^[5]。巨噬细胞是单核细胞分化的免疫吞噬细胞，几乎存在于所有组织中，尤其在黏膜表面特别丰富，通过识别、吞噬和破坏病原体，在新生隐球菌入侵机体期间参与第一道免疫防线，并可将先天免疫与适应性免疫反应联系起来，巨噬细胞可能是杀灭隐球菌及最终消除隐球菌感染的主要效应细胞^[6]。在机体免疫受损的情况下，隐球菌会从肺扩散到大脑，导致致命的隐球菌性脑膜炎，治疗困难，费用高。了解新生隐球菌和巨噬细胞之间相互作用的具体机制及可能结果，通过疫苗及预防性抗真菌治疗提高先天免疫效率，对降低隐球菌病的发生至关重要。笔者对新生隐球菌和巨噬细胞间的相互作用进行综述，包括新生隐球菌在巨噬细胞内存活，避免吞噬机制，以及与巨噬细胞极化的关系，从而为隐球菌病的治疗提供新思路和方法。

1 在巨噬细胞中的结局

了解新生隐球菌和巨噬细胞之间的相互作用是探索隐球菌性脑膜脑炎致病机制的基础。理想情况下，新生隐球菌与巨噬细胞保持着复杂的相互作用，从而达到良好的平衡关系，利于机体的稳态。研究^[7]证实，在宿主中新生隐球菌和巨噬细胞共同存活，从而导致潜伏感染。巨噬细胞吞噬新生隐球菌后，新生隐球菌在吞噬体内同时暴露于低pH值、低活性氧、低活性氮和营养缺乏的环境中^[8]，相应上调氧化应激酶、饥饿反应和自噬相关的基因表达，与自身黑色素和荚膜的抗氧化特性协同作用，从而有效地保护真菌免受宿主攻击。新生隐球菌感染后在巨噬细胞中的结局至少包括吞噬、复制、非溶解性胞吐及横向转移。

1.1 吞噬作用

巨噬细胞对新生隐球菌的吞噬作用受多种因素介导。靶向荚膜葡糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)的IgM和IgA促进补体非依赖及CD18依赖的吞噬作用^[9]。在缺乏sIgM的小鼠中，肺巨噬细胞吞噬新生隐球菌的功能明显受损^[10]。与IgG1、IgM和IgA不同，IgG3介导的吞噬作用与fcγ受体和CD18无关^[11]。新生隐球菌的抗吞噬蛋白1(antiphagocytic protein, App1)与补体受体2/3(complement receptor, CR2/CR3)结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用^[12]。巨噬细胞的吞噬作用与隐球菌性脑膜脑炎患者的高死亡率之间存在联系^[13]，对新生隐球菌的有效吞噬将导致疾病预后不良^[14]。

1.2 复制

Diamond等^[15]首先描述了新生隐球菌的胞内复制，观察到人类巨噬细胞内新生隐球菌的复制速度比在细胞外快。作为一种兼性细胞内病原体，新生隐球菌在巨噬细胞内复制并碱化巨噬细胞的吞噬体，导致吞噬体破裂及巨噬细胞溶解^[16]。新生隐球菌的增殖也可能刺激一些巨噬细胞的有丝分裂^[17]，但在长期的新生隐球菌感染中，隐球菌酵母能特异性地抑制细胞周期蛋白D1表达^[18]，从而减少巨噬细胞有丝分裂^[19]。因此，新生隐球菌的复制和巨噬细胞裂解/有丝分裂平衡背后的机制仍然需要探索。

1.3 排出

当新生隐球菌在巨噬细胞内存活时，某些机制允许其从巨噬细胞中排出，因此可能会增加组织中的真菌负担。新生隐球菌的增殖可促进巨噬细胞的溶解，从而进入组织^[20]。此外，研究发现在小鼠和人类巨噬细胞中，新生隐球菌在不杀死宿主细胞的情况下排出巨噬细胞的新机制^[21]，此过程称为非溶解性胞吐作用。这种排出可能发生在吞噬病原体数小时后，整个过程持续小于5 min^[22]。实时成像证实该过程依赖活酵母细胞^[23]，因为新生隐球菌分泌的毒力因子磷脂酶B1(phospholipase B1, PLB1)和SEC14基因，对于非溶解性胞吐是必需的^[24]。空泡ATP酶抑制剂，Arp2(actin-related proteins 2, Arp2)复合物介导的肌动蛋白聚合，Th1和Th17细胞因子，以及自噬基因的敲除能抑制非溶解性胞吐作用，氯化铵和氯喹以及Th2细胞因子增加非溶解性胞吐作用^[25-27]，可能导致新生隐球菌的排出和疾病的加重。

1.4 横向转移

活的新生隐球菌也可以从一个巨噬细胞转移到另一个巨噬细胞^[28]，并且与酵母细胞的内吞途径相互独立。与非溶解性胞吐相比，横向转移是一个肌动蛋白依赖过程，可以被细胞松弛素D抑制。横向转移可能在新生隐球菌潜伏期间反复发生，从而避免被免疫系统发现，防止被抗真菌药物杀灭。

2 抗吞噬作用

避免吞噬以逃避氧化应激和营养缺乏是新生隐球菌发病机制的核心。逃避吞噬作用的一种方法是通过改变其细胞形态，增大后的新生隐球菌菌体体积是酵母样新生隐球菌体积的5~10倍，被成为“titan cell”^[29]。由于巨噬细胞不能摄取这些巨型酵母细胞，使新生隐球菌在巨噬细胞外定植，从而易于侵入组织。新生隐球菌在组织表面形成生物膜和水通道结构，保护新生隐球菌免受组织抗微生物作用及巨噬细胞吞噬作用，增强真菌抗性、群体感应和存活能力^[30]。新生隐球菌也表达App1，其特异性抑制补体受体CR3的CD11b结构域，阻止CR3的配体iC3b被吞噬^[31]，因为抗体调理素化的细胞通过Fc受体内化而非CR3，故App1不能抑制抗体介导的吞噬作用^[31]。此外，带负电荷的新生隐球菌荚膜有助于产生静电排斥力，阻止细胞与细胞因接触而被吞噬^[32]。

在肺组织环境中，直径50~100 μm的巨型新生隐球菌细胞(超过标准酵母型10倍)有不同厚度的荚膜，使其对吞噬作用具有抗性^[29]。此外，新生隐球菌荚膜还具有掩盖其病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的功能，避免被宿主细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)识别，从而逃避免疫系统，防止被吞噬。总之，新生隐球菌已发展出多种机制来避免被巨噬细胞内化，其中一些依赖于荚膜，另一些依赖于抗吞噬蛋白和信号传导途径，因此，可以作为研究病原微生物与吞噬细胞相互作用的良好模型。

3 在巨噬细胞内存活的机制

新生隐球菌在吞噬细胞内杀伤及存活的能力，不仅对真菌的增加有重要影响，也对感染期间的真菌负担和传播有直接影响。已发现多种病原体在巨噬细胞内存活的机制，包括抑制吞噬体-溶酶体融合或避免被吞噬溶酶体杀灭。新生隐球菌的吞噬会形成较大的吞噬溶酶体^[33]。电子显微镜观察到吞噬溶酶体膜上存在空穴，表明含有新生隐球菌的吞噬溶酶体发生了泄漏^[16]，这些数据表明，尽管发生了吞噬溶酶体的融合，但新生隐球菌有能力削弱其功能，保证新生隐球菌在其中生存和复制，而且胞内新生隐球菌抑制一氧化氮(NO)的产生，而NO对杀灭吞噬的病原体起重要作用。荚膜多糖是新生隐球菌的主要毒力因子，对避免和干扰巨噬细胞的正常功能起着重要作用。荚膜是隐球菌胞内生存所必需的，无荚膜突变体不能在巨噬细胞内复制。荚膜可根据环境条件改变大小，在感染过程中，荚膜显著增大。研究^[34]表明，巨噬细胞提取物也可以诱导荚膜增大。巨噬细胞对于隐球菌病的早期控制至关重要，在被巨噬细胞吞噬的前2 h新生隐球菌多糖荚膜较小。随着荚膜的扩大，巨噬细胞的吞噬作用及对新生隐球菌的控制能力被限制。由于荚膜多糖具有抗氧化特性，因此，荚膜增大有助于避免新生隐球菌被杀灭。荚膜增大的细胞对自由基和抗菌肽的敏感性降低，表明荚膜增大通过一种“缓冲”或“捕获”机制来应对吞噬体的应激状态^[35]。荚膜变大还可以增大吞噬溶酶体的大小，稀释溶酶体内容物避免新生隐球菌被杀灭。此外，Feldmesser等^[36]观察到，在含有新生隐球菌酵母的吞噬溶酶体中，酵母细胞和吞噬溶酶体膜之间存在物理隔离。许多抗菌化合物是从膜上释放出来的，荚膜增大也可能有助于避免新生隐球菌被这些分子杀灭。由此可见，荚膜通过体积增大及结构变化来增强新生隐球菌抵抗外界环境的能力。

新生隐球菌具有多种内在物质，如荚膜、黑色素和抗氧化酶，能抵抗吞噬溶酶体的杀伤作用。此外新生隐球菌的胞外产物甘露醇和鞘脂，对抵抗巨噬细胞的杀菌作用及促进细胞内生存有一定的帮助^[37]。新生隐球菌还可通过产生胞外荚膜多糖干扰吞噬溶酶体和巨噬细胞的功能，从而在巨噬细胞内存活。

研究发现，巨噬细胞自身吞噬体的酸化有利于新生隐球菌在低pH值条件下存活和增殖^[38]，用氯喹处理巨噬细胞后，吞噬体pH值增加，导致新生隐球菌的增殖率降低^[39]。鼠RAW264.7巨噬细胞自噬基因ATGs (ATG5、ATG9a、ATG12)参与对新生隐球菌的吞噬过程，在感染15 h后，ATG2a、ATG5、ATG9a、ATG12和LC3增强新生隐球菌在巨噬细胞内的复制及逃逸能力^[40]。而敲除Atg2、Atg5或Atg9后，新生隐球菌的吞噬和/或复制显著减少，Atg5自噬基因的敲除同时减少新生隐球菌的非溶解性胞吐^[27]。

4 新生隐球菌感染与巨噬细胞极化的关系

成功根除新生隐球菌感染需要独特的适应性免疫应答。肺泡和肺组织中浸润的巨噬细胞吞噬并杀灭入侵的病原体，并且能将抗原呈递给活化的T细胞，以刺激免疫活性个体的适应性免疫应答。巨噬细胞具有动态可塑性，能根据细胞因子微环境的变化而改变其活化表型。巨噬细胞活化表型大致分为经典型(M1)或替代型(M2)。M1巨噬细胞通过产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)介导宿主防御微生物病原体。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)作用于底物L-精氨酸，产生NO，具有抗隐球菌特性^[41]。相反，精氨酸酶-1(Arginase -1, Arg-1)是M2巨噬细胞活化的标志性标记物，与iNOS竞争产生L-鸟氨酸和尿素的底物。Arg-1与iNOS的比例通常被认为是巨噬细胞极化表型的指标，因为活化M2巨噬细胞的条件抑制M1巨噬细胞活化。白细胞介素(IL)-4和IL-13细胞因子介导M2巨噬细胞的活化。一种由新生隐球菌分泌的热休克蛋白70同源物Ssa1，通过刺激IL-4和IL-13产生促进早期真菌生长及向M2巨噬细胞活化的转变^[42]。M2巨噬细胞有助于抑制和调节炎症反应，并在伤口愈合中起关键作用，但不具有抗新生隐球菌作用^[41]。新生隐球菌可以在M2巨噬细胞中存活，并将其作为逃避宿主识别及杀灭的保护性媒介^[43]。几丁质作为新生隐球菌细胞壁的组成部分，间接刺激IL-5和IL-13的产生，并可引发IL-4的产生，导致M2巨噬细胞活化^[44]，从而避免新生隐球菌被杀灭。

在干扰素(IFN)-γ存在下，用IL-4刺激向M1表型极化的巨噬细胞可以将其重新极化为M2表型。类似地M2表型的巨噬细胞可以在IFN-γ的存在下重新极化为功能性M1表型，并且能维持抗新生隐球菌活性^[45]，此标志着局部细胞因子可以驱动巨噬细胞的极化。Th1型T细胞和NK细胞产生的IFN-γ可以通过刺激信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT1)依赖的方式激活M1巨噬细胞^[46]，已证实STAT1信号传导是M1巨噬细胞活化和保护所必需的^[41]。但最近一项临床研究^[47]表明，尽管2例非HIV隐球菌性脑膜炎患者脑中IFN-γ水平和促炎因子水平升高，巨噬细胞却极化为吞噬能力较差的非保护性的M2表型，表明在人类新生隐球菌感染中巨噬细胞的极化非常复杂，且需要进一步研究。

新生隐球菌对M1巨噬细胞产生的NO敏感^[48]，但可以通过下调巨噬细胞iNOS RNA的表达，从而抑制NO的产生^[49]，抑制iNOS导致M2巨噬细胞活化，造成抗隐球菌活性丧失和疾病进展^[48]。此外，iNOS缺陷小鼠或用iNOS抑制剂处理的野生型小鼠的巨噬细胞，即使在ROS存在时也不能控制新生隐球菌的细胞内增殖^[41]，表明M1巨噬细胞利用NO，而不是ROS在小鼠中控制新生隐球菌的胞内增殖。然而，此发现是否适用于人类巨噬细胞仍存在争议，因为人类iNOS基因通常通过CpG甲基化、组蛋白修饰和染色质压缩被沉默^[50]。其他研究显示，人类肺组织中的肉芽肿和非人灵长类动物体内含有iNOS阳性的巨噬细胞^[51-52]，表明人类巨噬细胞能产生控制新生隐球菌生长的NO。为解决这个问题，需要进一步研究人类巨噬细胞对新生隐球菌感染的应答。

从治疗的角度来看，进一步剖析新生隐球菌感染期间巨噬细胞极化的信号传导机制，可以帮助诱导巨噬细胞向抗隐球菌表型的极化，并为抗隐球菌的保护性应答提供新的研究方向。已知多种信号组分参与巨噬细胞极化，包括DAP12(DNAX-activating protein of 12kDa)^[53]、HSP70(heat shock protein 70)^[44]和STAT1, 研究其他细胞内病原体，发现TLR(Toll-Like receptor, TLR)信号传导可诱导巨噬细胞中Arg1的产生^[54]，了解这些过程将有助于揭示哺乳动物中巨噬细胞极化对新生隐球菌感染结局的影响，并为治疗隐球菌病提供新的疫苗及免疫治疗方案。

5 结论及展望

巨噬细胞与新生隐球菌的相互作用是复杂的宿主与病原体关系中的一部分，这种关系对于感染的早期控制和清除至关重要。新生隐球菌可以逃避免疫系统的监察或调节宿主细胞，从而在巨噬细胞内存活和复制。而关于新生隐球菌如何与巨噬细胞相互作用，以及如何调节及逃避免疫应答，达到病原体与宿主之间的相对平衡，对于确定免疫反应的进行和疾病的结局至关重要。未来的研究可以集中在确定新生隐球菌和巨噬细胞之间特定分子的相互作用或信号通路的传导，以及这些相互作用如何导致疾病的发生、发展，巨噬细胞极化条件的控制等，充分了解隐球菌病潜伏状态与播散状态之间转换的重要特征，为开发以巨噬细胞为靶点的新型疫苗和免疫疗法来预防和治疗隐球菌病奠定重要基础。