目的了解常见革兰阴性（G-）菌菌群分布及耐药性变化，为临床合理使用抗菌药物提供可靠依据。方法采用回顾性调查方法，分析某院2009—2013年临床标本分离的主要G-菌及其耐药性。结果临床分离的主要G-菌数由2009年的1 189株增加至2013年的2 364株，常见居前4位的G-菌依次为大肠埃希菌3 331株（37.38%）、肺炎克雷伯菌1 623株（18.22%）、铜绿假单胞菌1 566株（17.58%）、鲍曼不动杆菌1 057株（11.86%）。2009—2013年产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌检出率分别为47.84%（144/301）、56.90%（301/529）、59.49%（395/664）、55.05%（469/852）、52.49%（517/985）；产ESBLs肺炎克雷伯菌检出率分别为35.68%（76/213)、41.00%（139/339）、36.75%（122/332）、41.78%（155/371）、36.96%（136/368）。产ESBLs大肠埃希菌耐药率较高，对大多数抗菌药物的耐药率＞50%；产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦较敏感。铜绿假单胞菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦保持较强的抗菌活性，耐药率＜20%；鲍曼不动杆菌对喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢吡肟耐药率均＞40%，5年间耐药趋势变化不大。结论该院G-杆菌耐药性强且多重耐药，必须加强合理使用抗菌药物，预防感染。